Bộ lọc huỳnh quang là một thành phần thiết yếu trong kính hiển vi huỳnh quang. Một hệ thống điển hình có ba bộ lọc cơ bản: bộ lọc kích thích, bộ lọc phát xạ và gương lưỡng sắc. Chúng thường được đóng gói trong một khối lập phương để có thể ghép nhóm lại với nhau vào kính hiển vi.
Bộ lọc huỳnh quang hoạt động như thế nào?
Bộ lọc kích thích
Bộ lọc kích thích truyền ánh sáng có bước sóng cụ thể và chặn các bước sóng khác. Chúng có thể được sử dụng để tạo ra các màu khác nhau bằng cách điều chỉnh bộ lọc để chỉ cho phép một màu đi qua. Bộ lọc kích thích có hai loại chính - bộ lọc thông dài và bộ lọc thông dải. Bộ kích thích thường là bộ lọc thông dải chỉ truyền các bước sóng được hấp thụ bởi fluorophore, do đó giảm thiểu sự kích thích của các nguồn huỳnh quang khác và chặn ánh sáng kích thích trong dải phát xạ huỳnh quang. Như được thể hiện bằng đường màu xanh lam trong hình, BP là 460-495, nghĩa là nó chỉ có thể đi qua vùng huỳnh quang 460-495nm.
Nó được đặt trong đường chiếu sáng của kính hiển vi huỳnh quang và lọc tất cả các bước sóng của nguồn sáng ngoại trừ phạm vi kích thích fluorophore. Mức truyền tối thiểu của bộ lọc quyết định độ sáng và độ sáng của hình ảnh. Nên truyền tối thiểu 40% cho bất kỳ bộ lọc kích thích nào sao cho mức truyền lý tưởng là >85%. Băng thông của bộ lọc kích thích phải hoàn toàn nằm trong phạm vi kích thích của fluorophore sao cho bước sóng trung tâm (CWL) của bộ lọc càng gần với bước sóng kích thích cực đại của fluorophore càng tốt. Mật độ quang của bộ lọc kích thích (OD) quyết định độ tối của hình nền; OD là thước đo mức độ bộ lọc chặn các bước sóng ngoài phạm vi truyền hoặc băng thông. Nên sử dụng OD tối thiểu là 3.0 nhưng OD từ 6.0 trở lên là lý tưởng.
Bộ lọc khí thải
Bộ lọc phát xạ phục vụ mục đích cho phép huỳnh quang mong muốn từ mẫu đến được máy dò. Chúng chặn các bước sóng ngắn hơn và có khả năng truyền cao đối với các bước sóng dài hơn. Loại bộ lọc cũng được liên kết với một số, ví dụ BA510IF trong hình (bộ lọc rào cản nhiễu), ký hiệu đó đề cập đến bước sóng ở mức 50% mức truyền tối đa của nó.
Các khuyến nghị tương tự đối với bộ lọc kích thích cũng đúng đối với bộ lọc phát xạ: đường truyền tối thiểu, băng thông, OD và CWL. Bộ lọc phát xạ với sự kết hợp CWL, truyền tối thiểu và OD lý tưởng cung cấp hình ảnh sáng nhất có thể, với khả năng chặn sâu nhất có thể và đảm bảo phát hiện các tín hiệu phát xạ mờ nhất.
Gương lưỡng sắc
Gương lưỡng sắc được đặt giữa bộ lọc kích thích và bộ lọc phát xạ ở góc 45° và phản xạ tín hiệu kích thích về phía fluorophore trong khi truyền tín hiệu phát xạ về phía máy dò. Các bộ lọc lưỡng sắc và bộ tách chùm tia lý tưởng có sự chuyển đổi rõ ràng giữa phản xạ tối đa và truyền tối đa, với độ phản xạ >95% đối với băng thông của bộ lọc kích thích và khả năng truyền >90% đối với băng thông của bộ lọc phát xạ. Chọn bộ lọc có lưu ý đến bước sóng giao nhau (λ) của huỳnh quang để giảm thiểu ánh sáng lạc và tối đa hóa tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu của hình ảnh huỳnh quang.
Gương lưỡng sắc trong hình này là DM505, được đặt tên như vậy vì 505 nanomet là bước sóng ở mức 50% độ truyền tối đa của gương này. Đường cong truyền của gương này cho thấy độ truyền qua cao trên 505 nm, độ truyền qua giảm mạnh ở bên trái 505 nanomet và độ phản xạ tối đa ở bên trái 505 nanomet nhưng vẫn có thể có một số đường truyền dưới 505 nm.
Sự khác biệt giữa bộ lọc thông dài và thông dải là gì?
Bộ lọc huỳnh quang có thể được chia thành hai loại: thông dài (LP) và thông dải (BP).
Bộ lọc thông dài truyền các bước sóng dài và chặn các bước sóng ngắn hơn. Bước sóng giới hạn là giá trị ở mức 50% truyền đỉnh và tất cả các bước sóng trên giới hạn được truyền bởi các bộ lọc thông dài. Chúng thường được sử dụng trong gương lưỡng sắc và bộ lọc phát xạ. Nên sử dụng bộ lọc đường dài khi ứng dụng yêu cầu thu phát xạ tối đa và khi không muốn hoặc không cần phân biệt quang phổ, điều này thường xảy ra đối với các đầu dò tạo ra một loại phát xạ duy nhất trong mẫu vật có mức độ tự phát huỳnh quang nền tương đối thấp.
Bộ lọc thông dải chỉ truyền một dải bước sóng nhất định và chặn các dải bước sóng khác. Chúng giảm nhiễu xuyên âm bằng cách chỉ cho phép truyền đi phần mạnh nhất của phổ phát xạ fluorophore, giảm nhiễu tự phát huỳnh quang và do đó cải thiện tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu trong các mẫu tự phát huỳnh quang nền cao mà các bộ lọc thông dài không thể cung cấp.
BestScope có thể cung cấp bao nhiêu loại bộ lọc huỳnh quang?
Một số loại bộ lọc phổ biến bao gồm bộ lọc màu xanh lam, xanh lục và tia cực tím. Như thể hiện trong bảng.
| Bộ lọc | Bộ lọc kích thích | Gương lưỡng sắc | Bộ lọc rào cản | Độ dài sóng đèn LED | Ứng dụng |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485nm | ·FITC: Phương pháp kháng thể huỳnh quang ·Axit cam: DNA, RNA ·Auramine: Trực khuẩn lao ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535nm | ·Rhodamine, TRITC: Phương pháp kháng thể huỳnh quang ·Propidium iodide: DNA ·RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365nm | ·Quan sát huỳnh quang tự động ·DAPI: nhuộm DNA ·Hoechest 332528, 33342: dùng để nhuộm nhiễm sắc thể |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405nm | ·Catecholamine ·tryptamine 5-hydroxy ·Tetracycline: Xương, Răng |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640nm | ·Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Các bộ lọc được sử dụng trong việc thu nhận huỳnh quang được thiết kế xung quanh các bước sóng chính được sử dụng trong các ứng dụng huỳnh quang, dựa trên các chất huỳnh quang được sử dụng nhiều nhất. Vì lý do này, chúng cũng được đặt tên theo chất fluorophore mà chúng dùng để chụp ảnh, chẳng hạn như các khối lọc DAPI (xanh dương), FITC (xanh lá cây) hoặc TRITC (đỏ).
| Bộ lọc | Bộ lọc kích thích | Gương lưỡng sắc | Bộ lọc rào cản | Độ dài sóng đèn LED |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535nm |
| FL-Auramine | BP470 | DM480 | BA485 | 450nm |
| Texas đỏ | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560nm |
Làm thế nào để bạn chọn một bộ lọc huỳnh quang?
1. Nguyên tắc chọn bộ lọc huỳnh quang là để ánh sáng huỳnh quang / phát xạ đi qua đầu hình ảnh càng xa càng tốt, đồng thời chặn hoàn toàn ánh sáng kích thích để đạt được tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu cao nhất. Đặc biệt đối với ứng dụng kích thích đa photon và kính hiển vi phản xạ nội toàn phần, nhiễu yếu cũng sẽ gây nhiễu lớn cho hiệu ứng hình ảnh, do đó yêu cầu về tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu cao hơn.
2. Biết phổ kích thích và phát xạ của chất huỳnh quang. Để xây dựng bộ lọc huỳnh quang tạo ra hình ảnh chất lượng cao, độ tương phản cao với nền đen, các bộ lọc kích thích và phát xạ phải đạt được độ truyền cao với độ gợn băng thông tối thiểu trên các vùng tương ứng với các đỉnh hoặc phát xạ kích thích fluorophore.
3. Xem xét độ bền của bộ lọc huỳnh quang. Các bộ lọc này phải không thấm vào các nguồn ánh sáng cường độ cao tạo ra tia cực tím (UV) có thể dẫn đến “cháy”, đặc biệt là bộ lọc kích thích vì nó phải chịu toàn bộ cường độ của nguồn chiếu sáng.
Hình ảnh mẫu huỳnh quang khác nhau
Các tài nguyên được thu thập và tổ chức trên Internet và chỉ được sử dụng cho mục đích học tập và liên lạc. Nếu có vi phạm vui lòng liên hệ với chúng tôi để xóa.
Thời gian đăng: Dec-09-2022